从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA

一．实验目的

1、了解从细胞中提取DNA的基本原理

2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量DNA的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事项。

二．实验原理

1.用蛋白酶K（使膜上蛋白变性分解）和去污剂SDS（破坏细胞膜的脂质结构）共同消化细胞。

2.然后酚、氯仿等有机溶剂进行抽提，进行DNA的纯化，去掉蛋白质、RNA、多糖等生物大分子。

3.最后用无水乙醇沉淀DNA，干燥后用TE溶解，在4℃下可保存一年。

三．实验步骤

1、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用1ml生理盐水洗涤，后将1.5ml液体转入1个干净的EP管中，2000rpm离心5分钟，倒掉上清。

2、重复用1.0ml生理盐水洗涤沉淀1次，离心，去上清。

3、沉淀中加500μl 1x细胞裂解液（STE），打散细胞团、混匀，再加15μl 20mg/ml蛋白酶K，充分混匀。 55℃水浴30min。

4、加500μl饱和酚，轻摇混匀，室温12000rpm离心10min。

5、上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）移至另一加入装有500μl氯仿的EP管，轻摇混匀，室温12000rpm离心10min。

6、吸取400μl上清（注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相）至已装有900 μl预冷无水乙醇的离心管，混合均匀，可见白色絮状沉淀，10000rpm离心5min，DNA沉淀在管底。

7、去上清，加入70%乙醇1ml清洗沉淀，10000rpm离心5min，去上清（尽量用小枪头将液体去干净，但注意不要将沉淀也吸走），室温干燥5min，再用50μl TE buffer溶解沉淀，4℃储藏备用。四．实验结果

五．结果分析 编号：100 如图所示，100号几乎没有提取出DNA，只有很弱的一条带，如果量再多一些的话，应该也看得到会有几条带。经过分析后认为主要以下几点原因：

【1】.唾液稀释过度，导致取到的细胞很少。

【2】.在破碎细胞的时候进行的不彻底，没有混匀，导致DNA抽提不完全。

【3】.加入活性去污剂到加热30min的间隔有些长导致部分DNA被DNA水解酶降解。

【4】.加入饱和酚的时候没有摇匀，蛋白质的去除不彻底，部分DNA与蛋白质结合，在分离DNA去除蛋白质的时候损失了不少DNA。此外，不同的条带代表提取出的DNA的大小不同，在实验过程中，可能由于剧烈震荡，或DNA水解酶的缘故使得DNA链被打断。因此出现了不同的几个条带。

六．注意事项

1.取唾液时既不能过分稀释，也不能太粘稠，发现细胞不足时要及时补充。

2.裂解细胞的时候，要充分混匀活性去污剂，但震荡也不能太剧烈。最好及时放入水域锅中加热。

3.加苯酚后要充分混匀，之后离心，尽可能多的将上清吸出，但注意不要取到中间的蛋白质。

4.在最后用70%的乙醇清洗DNA后要尽可能多的把上清吸走。

5.提取到的DNA要用TEbuffer保存。